哥哥的毕业论文在《中国微生态学杂志》上发表
林创华
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利用食品厂的废料发酵生产饲用微生物添加剂
莫美华 林创华 冼毅和 邓宏益 谢秀菊 摘要： 利用枯草芽胞杆菌，以玉米废渣为原料发酵生产饲用微生物添加剂，结果发酵产品的活菌数为1.76×1011个/kg，粗蛋白质含量为52%，比原料的粗蛋白质含量提高了28%；用均匀设计的方法设计四种酵母菌混合发酵模式，以啤酒糟为原料，生产饲用微生物添加剂，结果四种酵母菌的最佳接种量比例为：酿酒酵母：红酵母：热带假丝酵母：白地霉＝5：0：0：5；发酵产品的最高活菌数为2.77×1011个/kg，最高粗蛋白含量为62.81%。 关键词：饲用微生物添加剂；发酵；啤酒糟. 中图分类号：R37 文献标识码：A 文章编号：1005-376X(2000)10-0255-03 抗生素作为畜禽生长促进剂，在抗菌促生长的同时，也抑杀了动物体内的有益菌，破坏了肠道微生态平衡，出现菌群失调现象，导致动物对病原菌的易感性。抗生素在动物产品中的残留和对环境的污染给人类健康带来的危害也日益引起人们的不安。因此，人们对能克服抗生素种种弊端，无污染、无残留、无抗药性的益生素就日趋关注［1］。饲用微生物添加剂包括益生素和微生物促生长剂两大类，它是一些有益于畜禽胃肠道微生物平衡的活的或死的微生物及其产物。它通过改善畜禽肠道内的微生物群落，竞争性排斥胃肠道内的病原性微生物，维持胃肠道内环境的动态平衡，增强消化功能，促进营养物质的吸收、消化和转化，从而改善饲料的营养与动物的健康，提高禽畜的生产力和抗病力。微生物添加剂在美国、欧洲、中南美洲和东南亚等地已普遍使用，这样可减少抗生素的运用，有益于人的健康与环保［2］。由于近几年养殖业的迅速发展，对饲用微生物添加剂的需求量也就越来越大，但目前我国在这方面的研究仍处于起步阶段，大部分产品仍依赖进口，因此开展这方面的研究具有非常广阔的前景。 1 材料与方法 1.1 材料 枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)：本室分离保存的菌种；酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)：本室分离保存的菌种；红酵母：本室分离的菌种，待鉴定；热带假丝酵母GIM2.6(Candida tropicalis)：购于广东省微生物研究所；白地霉GIM2.12(Geotrichum candidum)：购于广东省微生物研究所；啤酒糟：取自中国(广州)珠江啤酒厂；玉米废渣：取自华南农业大学动科系猪场；麦芽汁培养基：将麦芽粉加四倍水，在65℃条件下水溶糖化3～4h，用碘液测定无兰色反应为止。煮沸，过滤，稀释至5～6波美度(Be°)或10°糖度(勃力克度)，pH 6.0～6.4，分装于大试管中(每支装培养基5ml)和三角瓶中(每瓶装培养基40ml)；麦芽琼脂培养基：麦芽汁1000ml，琼脂2%，pH 6.0～6.4，分装，灭菌，制成斜面。发酵培养基1：玉米废渣10%，尿素0.18%，KH2PO40.2%，FeSO40.01%，MgSO47H2O0.067%，CaCl20.01%,pH7.2～7.4，用于枯草芽胞杆菌的发酵；发酵培养基2：啤酒糟99%，(NH)2SO40.4%，Na2HPO4*12H2O0.2%，糖化酶0.4%，pH5.0，用于酵母菌的发酵。 1.2 试验方法 1.2.1 枯草芽胞杆菌的发酵 取在牛肉膏蛋白胨斜面培养基上培养1d的菌种，接一环于盛有30ml肉汤培养基的三角瓶中(经121℃，30min灭菌)，置于温度设为30℃，振荡速度为200r/min的摇床上，振荡培养22h。再将上述扩大的菌种液以1：10的比例接种于经灭菌的发酵培养基中(150ml的三角瓶装培养基30ml)，于振荡速度为250r/min，温度为30℃的摇床上，振荡培养72h。 1.2.2 酵母菌的发酵 将斜面菌种活化后，接种一环到装有5ml麦芽汁的大试管中，置于28℃，振荡速度为220r/min的摇床上培养20h。再以5%接种量接种于装有40ml麦芽汁的三角瓶中，于28℃，振荡速度为220r/min的摇床上培养24h。 将四种菌液按表1的接种量接入装有100g固体发酵培养基的500ml烧杯中，并用灭菌的玻棒搅拌均匀，28℃，静置培养72h。 1.2.3 各菌种接种量的最佳配比方案筛选的试验本试验采用均匀设计的方法设计。均匀设计是方开泰等在数论方法的基础上提出的，该设计是一种将数据处理和回归分析统一成整体的可靠有效的设计方法，在安排多因素、多水平、多指标的试验中有许多突出的优点。具体方法步骤参考文献［3］。 1.2.4 产品烘干方法 发酵结束后，将发酵液离心，置于45℃干燥箱中干燥。固体发酵产品直接置于干燥箱中干燥。 1.2.5 产品质量检测方法 活菌数测定：采用稀释平板计数法；粗蛋白含量测定：采用凯氏定氮法［4］。 2 结 果 2.1 枯草芽胞杆菌发酵试验结果 枯草芽胞杆菌发酵结果如表1。从表1可见：利用枯草芽胞杆菌发酵玉米废渣生产饲用微生物添加剂，经检测，发酵产品的活菌数为1.76×1011个/kg；粗蛋白含量为52%，比原料中的粗蛋白含量提高了28%。 表1 枯草芽胞杆菌发酵试验结果 检测项目 发酵产品 玉米废渣 粗蛋白含量(%，W/W) 活菌数(个/kg) 52 1.76×1011 24 - 2.2 酵母菌混合发酵的试验统计与分析 混合发酵中各菌种的配比采用四因子六水平的均匀设计表；各因素的水平设计如表2；该试验的试验方案及结果列于表3。 表2 四种酵母菌接种量水平设计表 因素水平 酿酒酵母 (%) 红酵母 (%) 热带假丝酵母 (%) 白地霉 (%) 1 2 3 4 5 6 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 表3 四种酵母菌不同配比筛选方案及结果 组 别 X1 (酿酒酵母) (%) X2 (红酵母) (%) X3 (热带假丝酵母) (%) X4 (白地霉) (%) Y1 (粗蛋白含量) (%) Y2 (活菌数) (×1011个/kg) 1 2 3 4 5 6 0 1 2 3 4 5 1 3 5 0 2 4 2 5 1 4 0 3 5 4 3 2 1 0 29.60 26.25 37.16 32.33 38.73 26.27 1.41 1.25 1.53 1.48 1.68 0.96 根据表3结果建立二次回归方程： Y1=0.351575000-0.00439285714x2-0.02365714296x3-0.0001414285714x42+0.01121392857x1x4 Y2=1.492714286-0.0260952381x1x3-0.0509047619x1x2-0.01219047619x23-0.01066666667x2x4 根据回归方程得出其显著性检验如表4。 表4 回归方程提炼显著性检验表 目标函数 相关系数 R 调整后的相关系数 Ra 剩余标准差 S F值 显著水平 P Y1 Y2 0.999999 0.999763 0.999995 0.998815 0.0002 0.0122 123773.1714 527.3333 0.0021 0.0326 从表4中可见：以粗蛋白含量为目标函数的方程1的显著水平P=0.0021 方程中各项回归系数的t检验结果如表5。从表5中可见：方程1中各回归项的显著水平均小于0.01，即达到0.01显著水平，说明红酵母、热带假丝酵母、白地霉的接种量对粗蛋白含量有极显著影响。酿酒酵母与白地霉之间的交互作用也对粗蛋白含量有极显著的影响；方程2中引入的前两项的显著水平小于0.01，后两项的显著水平小于0.05，说明酿酒酵母与热带假丝酵母和白地霉的交互作用对产品中活菌数有极显著的影响，红酵母与热带假丝酵母和白地霉的交互作用对产品中活菌数有显著的影响。 样品的观测值和拟合值列入表6，根据表6数据作图如图1、图2。从表6、图1和图2中可见：方程1的拟合误差均很小，最大的只有0.000096，拟合度为100%；方程2的拟合误差均为0.005，拟合度为99.95%，这说明两个方程的可信度均很高。 表5 各回归项的回归系数的t检验结果 方程1(Y1) 方程2(Y2) 偏相关系数 T检验值 显著水平P 偏相关系数 T检验值 显著水平P R(y,2)=-1.0000 R(y,3)=-1.0000 R(y,8)=0.9982 R(y,11)=1.0000 104.381 562.129 16.803 385.607 0.0001 0.0000 0.0035 0.0000 R(y,10)=-0.9981 R(y,11)=-0.9983 R(y,12)=-0.9907 R(y,13)=-0.9847 16.174 16.894 7.293 5.657 0.0038 0.0035 0.0183 0.0299 表6 样品的观测值和拟合值 组 别 方程1(Y1) 方程2(Y2) 观测值 拟合值 拟合误差 观测值(×1011) 拟合值(×1011) 拟合误差 1 2 3 4 5 6 0.2960 0.2625 0.3716 0.3233 0.3873 0.2627 0.2926 0.2624 0.3717 0.3234 0.3872 0.2627 -0.000032 0.000096 -0.000064 -0.000064 0.000096 -0.000032 1.4100 1.2500 1.5300 1.4800 1.6800 0.9600 1.4150 1.2550 1.5250 1.4850 1.6750 0.9550 -0.00500 -0.00500 0.00500 -0.00500 0.00500 0.00500 图1 方程1的观测值和拟合值图 图2 方程2的观测值和拟合值图 对方程1和方程2进行模型模拟，得到不同菌种的最佳接种量比例为：酿酒酵母：红酵母：热带假丝酵母：白地霉=5：0：0：5。说明本室所分离的酿酒酵母与所购买的白地霉以5：5的比例接种发酵，对提高产品中的粗蛋白含量和活菌数均有很大作用。用最佳接种量比例接种，可得到最高粗蛋白含量为62.81%，最大活菌数为2.77×1011/kg。 3 讨 论 本文利用分离到的枯草芽胞杆菌发酵玉米废渣生产饲用微生物添加剂，发酵产品中活菌数为1.76×1011/kg，粗蛋白含量为52%，比原料中粗蛋白含量提高了28%，说明该菌能明显提高产品的粗蛋白含量，具有很好的经济效益和社会效益。 从四种酵母菌混合发酵的模式看，分离的酿酒酵母和购买的白地霉对提高产品中的粗蛋白含量和产品中的活菌数均有很大作用，四种酵母菌的最佳接种量比例为：酿酒酵母：红酵母：热带假丝酵母：白地霉=5：0：0：5。 莫美华（华南农业大学 食品系微生物教研室，广东广州510642） 林创华（华南农业大学 食品系微生物教研室，广东广州510642） 冼毅和（华南农业大学 食品系微生物教研室，广东广州510642） 邓宏益（华南农业大学 食品系微生物教研室，广东广州510642） 谢秀菊（广州市农科所，广东广州510308） 参考文献： ［1］苏 军，汪 莉.益生素与有机酸对肉鸡生产性能的综合效应［J］.中国饲料，1999，(8)：17-20. ［2］黄承凤.饲用益生素［J］.中国饲料，1998，(2)：24-25. |